L'Unité d'Immunologie Moléculaire étudie les mécanismes moléculaires de l'activation des lymphocytes T. Les signaux adressés au lymphocyte T (LT) par la cellule présentatrice d'antigène (CPA) sont relayés à l'intérieur de la cellule par une multitude de protéines intracellulaires (telles que des tyrosine et sérine/thréonine kinases, des protéines adaptatrices, des petites protéines G et des composants du cytosquelette). Ce système décode les signaux (positifs et négatifs) provenant de l'extérieur et détermine le devenir des LT en cellules effectrices de la réponse immunitaire, en cellules mémoires ou en les rendant incapables de répondre (cellules " anergisées ") au travers de mécanismes qui impliquent la prolifération, la re-programmation génique ou encore la mort cellulaire.
Nos projets de recherches portent sur la compréhension du rôle et la régulation fine d'un certain nombre d'éléments de l'appareil de signalisation.
Mécanisme de contrôle de l'activité de Lck par CD45 (Claudine Irles et Frédérique Michel)
La protéine tyrosine kinase (PTK) Lck contrôle le seuil d'activation des LT en déclenchant des événements biochimiques complexes, en cascade, aboutissant à la prolifération et la différenciation du LT. Lck est soumis en même temps à un contrôle positif de la part de la tyrosine phosphatase transmembranaire CD45 et négatif par la PTK Csk qui est associée, dans les LT au repos, à la protéine membranaire PAG/Cbp résidante dans les GEMs (glycosphingolipid-enriched membranes) ou " radeaux lipidiques ". L'équilibre entre ces deux effets opposés régule la réactivité (le seuil d'activation) du LT. CD45 est exprimé sous forme de plusieurs isoformes au cours du développement thymique et de la différenciation des LT après stimulation par l'antigène. Ceux-ci (i.e. CD45RAB et CD45RO) diffèrent par les dimensions et le degré de glycosylation de leur ectodomaine. Le rôle de l'ectodomaine de CD45 a été étudié dans le but de déterminer s'il régule l'activité de CD45. Cette question a été abordée à l'aide de chimères de CD45, dont les ectodomaines respectifs (empruntés à d'autres récepteurs membranaires) étaient de taille et de glycosylation différentes ou similaires à celles de CD45. Nos travaux montrent que l'ectodomaine de CD45 régule finement sa fonction en influençant son interaction avec les " radeaux lipidiques ". De ce fait, l'ectodomaine de CD45 détermine l'état d'activation de Lck présent dans les " radeaux lipidiques " et la réponse du LT à l'engagement du TCR par l'antigène. Nos études suggèrent fortement qu'une interaction in cis existe au niveau membranaire entre CD45 et un ou plusieurs composants présent(s) dans les " radeaux lipidiques " (selon le modèle indiqué dans la figure 1).
Régulation et rôle de la protéine tyrosine kinase ZAP-70 pendant l'activation des LT (Vincenzo Di Bartolo, en collaboration avec B. et M. Malissen)
Zap-70 (Zeta chain-associated protein de 70 kDaltons) est une protéine tyrosine kinase (PTK) essentielle dans le déclenchement de l'activation du LT. Elle s'associe au récepteur de l'antigène (TCR) quand celui-ci est engagé par son ligand (le complexe antigène/CMH). Zap-70 possède une région de connexion (dite interdomaine B ; l'IB) entre ses deux domaines SH2 et son domaine tyrosine kinase. Dans l'IB résident des tyrosines régulatrices que nous avons précédemment décrites comme étant phosphorylées lorsque le TCR est stimulé. Nous avons étudié le rôle des tyrosines 315 (Y315) et 319 (Y319) de l'interdomaine B in vivo en collaboration avec le groupe de Bernard et Marie Malissen à Marseille, chez des souris " knock-in " portant l'une ou l'autre tyrosine mutée. Au travers de cette étude, nous avons conclu que par un mécanisme allostérique, la Y315 assure une association efficace de Zap-70 aux motifs ITAM des chaînes CD3-zeta du TCR mais joue un rôle mineur dans le développement. En revanche, la Y319 provoque un défaut grave de sélection positive thymique et confirme in vivo son importance dans la régulation de la fonction de Zap-70.
Une autre étude menée en collaboration avec l'équipe de C. Hivroz (Institut Curie, Paris) vient de révéler que, bien qu'essentiel pour le recrutement des principaux composants de signalisation et de l'orientation des microtubules vers le contacte TL-APC (une fonction apparemment requise pour la polarisation des processus de sécrétion et endocytose). Toutefois, de manière inattendue, une partie de la configuration de la synapse immunologique (par exemple, la topologie de ségrégation des protéines CD2 et CD45, dans la forme de supra-molecular activation clusters, SMAC) est normale en absence de Zap-70. Ces observations laissent supposer que, outre ZAP-70, d'autres kinases jouent un rôle important dans la formation de la synapse immunologique.
http://www.pasteur.fr/icono/RAR/RAR2002/photo_1_Immol.jpgMécanismes moléculaires de la co-stimulation CD28 : nouvelles voies de signalisation (Fabien Blanchet)
Une autre étude a porté sur l'identification de nouvelles voies de signalisation activées par CD28, le récepteur de co-stimulation nécessaire pour une prolifération et différentiation optimales des LT au cours de la réponse immunitaire. Nos travaux, à l'aide de la spectrométrie de masse, ont permis d'identifier de nouveaux partenaires de signalisation qui interagissent avec CD28. Ces études ont mené à l'identification d'au moins deux nouveaux partenaires interagissant avec le domaine cytoplasmique de CD28. En outre, ces mêmes études ont révélé des connexions, insoupçonnées jusqu'à présent, du signal CD28, à certaines voies métaboliques contrôlant des modifications post-traductionnelles de protéines de signalisation et la croissance cellulaire.
Etude de la fonction de la protéine adaptatrice SH3P7 et la synapse immunologique. (Setsuko Mise-Omata)
Nous avons entamé une étude de la fonction de la protéine SH3P7, récemment identifiée. SH3P7 est une protéine adaptatrice qui possède un domaine de type SCAD qui lie l'actine polymérisée et un domaine de type SH3. Des données récentes ont démontré que SH3P7 est capable de former un complexe avec la dynamine 1 (appelée également " pinchase "), une des protéines qui contribuent au mécanisme de formation des vésicules endocytiques. Toutefois, la fonction précise de SH3P7 n'est pas claire et afin de la découvrir nous avons appliqué la technique d'ARN-interférence (ARNi). En transfectant dans des cellules 293T un oligonucléotide d'ARN double brin, correspondant à une séquence de SH3P7, nous avons inhibé fortement l'expression de la protéine SH3P7. L'analyse par microscopie en immunofluorescence de ces cellules montre une forte inhibition de l'endocytose du récepteur de la transferrine avec quasi-disparition du compartiment endocytique précoce (early endosome, EE). Ces données montrent pour la première fois que SH3P7 est impliquée dans la formation des vésicules de la membrane plasmique dérivées du processus d'endocytose (in press). Nous avons aussi obtenu par ARNi l'ablation stable mais partielle de SH3P7 dans des lignées de lymphocytes T. Nous testons les conséquences de l'absence de l'expression de SH3P7 sur la formation de la synapse immunologique et sur la transmission du signal dans les LT.
Légende de la Figure 1 :
Représentation schématique du mécanisme par lequel CD45 régule positivement l'activité de Lck à travers une interaction faible avec les radeaux lipidiques (en déphosphorylant le site de régulation négative, la tyrosine 505, qui est contrôlée par la PTK Csk recrutée à la membrane via la protéine PAG/Cbp). X représente un composant hypothétique du raft responsable de cette interaction.
Mots-clés: Lymphocytes T, kinases, phosphatases, protéines adaptatrices, synapse immunologique
